Qualitätsmanagement
1/2018 FOOD-Lab 53
Letztendlich wurden die Glutengehalte in verschiedenen Mustern
Weizenstärke mittels LC-MS/MS bestimmt und die Glutengehalte als
Summe aller Gehalte an Glutenproteintypen ausgedrückt. Diese Ergebnisse
wurden anschließend mit den von zwei weiteren, unabhängigen
Methoden, dem R5 ELISA und der Gelpermeations-HPLC mit
Fluoreszenzdetektion (GP-HPLC-FLD), verglichen (Abb. 3).
Die drei verschiedenen Methoden zur Bestimmung von Gluten
ergaben für Weizenstärke W1 signifikant unterschiedliche Glutengehalte,
aber sie lagen alle im gleichen Bereich zwischen 82,5 mg/kg
und 103,6 mg/kg. Bei W2 zeigten alle drei Methoden eine sehr gute
Übereinstimmung (424,4 mg/kg bis 442,7 mg/kg). Der Glutengehalt
von W3 war im Vergleich zu W1 und W2 insgesamt deutlich höher,
wobei der mittels LC-MS/MS bestimmte Gehalt (9114 mg/kg) signifikant
geringer war als der des ELISA (11903 mg/kg). Der über GPHPLC
FLD bestimmte Glutengehalt (10371 mg/kg) lag dazwischen.
Ein Grund könnte sein, dass die in W3 vorhandenen Glutenproteine
im Vergleich zum Mehl geringere Mengen der spezifischen Markerpeptide
enthielten. Ein deutlicher Vorteil der LC-MS/MS-Methode ist,
dass die detektierten Markerpeptide den Glutenproteintypen zugeordnet
und somit Informationen über die Glutenzusammensetzung
erhalten werden können.
Die Analyse von Glutenpeptiden in Lebensmitteln mittels LC-MS/
MS ist derzeit noch auf spezialisierte Labors oder Forschungsinstitute
beschränkt, weil die instrumentelle Ausrüstung sehr teuer ist und
vertiefte Fachkenntnisse zur Durchführung der Messungen und zur
Datenauswertung erforderlich sind. LC-MS/MS kann daher als unabhängige
Methode dienen, um die Ergebnisse von ELISA-Messungen
zu überprüfen, insbesondere wenn widersprüchliche Ergebnisse bei
der Analyse komplexer Proben auftreten. Allerdings gibt es noch keine
validierte LC-MS/MS-Methode, die Peptide aus allen Glutenproteintypen
erfasst. Trotz der genannten Nachteile eröffnen LC-MS/
MS-Methoden wegen ihrer Selektivität, Sensitivität, Flexibilität und
ihrer Anwendbarkeit auch bei Proben mit erhitztem oder partiell hydrolysiertem
Gluten neue Perspektiven für die Quantifizierung von
Gluten in Lebensmitteln. Ein weiterer Vorteil ist die Möglichkeit der
Entwicklung von Multimethoden, die Gluten und weitere Allergene
in einer Messung gemeinsam detektieren11.
Schlussfolgerungen
Zur Quantifizierung von Gluten werden aktuell vor allem ELISA Testkits
und qPCR genutzt, da diese Methoden für die Routineanalytik
tauglich sind und gute Spezifität und Sensitivität aufweisen, um die
Einhaltung des laut Gesetzgebung festgelegten Grenzwerts von 20
mg Gluten/kg zu verifizieren. Allerdings weisen diese Methoden einige
Nachteile auf, wie die schlechte Vergleichbarkeit verschiedener
Testkits und der Einfluss der Lebensmittelmatrix und -verarbeitung
auf die Detektionsempfindlichkeit. Die LC-MS/MS ist daher aufgrund
ihrer hohen Selektivität, Sensitivität und Vielseitigkeit eine sehr vielversprechende
Methode zur Quantifizierung von Gluten, die mit fortschreitender
Weiterentwicklung der Messgeräte und Datenbanken
ganz neue Möglichkeiten in der Analytik eröffnet. Ein entscheidender
Punkt, der für alle Methoden gleichermaßen gilt, ist, dass gut charakterisierte
Referenzmaterialien zur Kalibrierung benötigt werden,
die für den Analyten Gluten möglichst repräsentativ, reproduzierbar
herstellbar und allgemein akzeptiert sind.
Literatur
1 Scherf, K.A. et al.: “Gluten and wheat sensitivities – an overview”;
J. Cereal Sci., 67, 2-11, 2016
2 Codex Standard 118-1979 (2015) Codex Alimentarius Commission.
Revision 1, Amendment 2
3 Schalk, K et al.: “Isolation and characterization of gluten protein
types from wheat, rye, barley and oats for use as reference materials”;
Plos One, 12, e0172819, 2017
4 Scherf, K.A., Poms, R.E.: “ Recent developments in analytical methods
for tracing gluten”; J. Cereal Sci., 67, 112-122, 2016
5 Scherf, K.A.: “Gluten analysis of wheat starches with seven
commercial ELISA test kits - up to six different values”; Food Anal.
Method., 10, 234-246, 2017
6 Lexhaller, B.: “Fundamental study on reactivities of gluten protein
types from wheat, rye and barley with five sandwich ELISA test
kits”; Food Chem., 237, 320-330, 2017
7 Zeltner, D. et al.: “Real-time PCR systems for the detection of the
gluten-containing cereals wheat, spelt, kamut, rye, barley and oat”;
Eur. Food Res. Technol., 228, 321-330, 2009
8 Scharf, A. et al.: “Performance of ELISA and PCR methods for the
determination of allergens in food: an evaluation of six years of
proficiency testing for soy (Glycine max L.) and wheat gluten (Triticum
aestivum L.)”; J. Agric. Food Chem., 61, 10261-10272, 2013
9 Schalk, K. et al.: “Targeted liquid chromatography tandem mass
spectrometry to quantitate wheat gluten using well-defined reference
proteins”; Plos One, 13, e0192804, 2018
10 Schalk, K. et al.: “Quantitation of specific barley, rye and oat marker
peptides by targeted liquid chromatography - mass spectrometry
to determine gluten concentrations”; J. Agric. Food Chem.,
DOI: 10.1021/acs.jafc.7b05286, 2018
11 Gomaa, A., Boye, J.: “Simultaneous detection of multi-allergens in
an incurred food matrix using ELISA, multiplex flow cytometry and
liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS)”; Food Chem.,
175, 585-592, 2015
Abb. 3: Glutengehalte von drei Weizenstärken W1, W2 und W3, die
mit drei voneinander unabhängigen Methoden quantifiziert wurden.
Unterschiedliche Kleinbuchstaben kennzeichnen signifikante Unterschiede
zwischen den drei Methoden (ANOVA, Tukey’s Test, p <
0,05). GP-HPLC-FLD, Gelpermeations-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
mit Fluoreszenzdetektion, HMW-GS, hochmolekulare
Glutenin-Untereinheiten, LMW-GS, niedermolekulare Glutenin-Untereinheiten,
R5 ELISA, Ridascreen Gliadin, r-biopharm, Darmstadt