Qualitätsmanagement
1/2018 FOOD-Lab 19
der Tandem-Massenspektrometrie große Hoffnungen
ruhen. Für den quantitativen Nachweis
von Proteinen ist insbesondere die Kombination
aus Flüssigkeitschromatographie und Elektrospray
Ionisation (ESI) Triple Quadrupole MS (TQMS)
in der Anwendung. Die Spezifität des Nachweises
erfolgt üblicherweise über die Detektion
festgelegter spezifischer Peptidsequenzen, die
nach Möglichkeit von verschiedenen Proteinen
stammen sollten.
Prinzip
Vergleichbar mit den immunologischen Verfahren
beginnt die Analyse mit der Extraktion
der Proteine aus einer zuvor homogenisierten
Probe. Damit die Proteine enzymatisch zerlegt
(zumeist Trypsin) werden können, muss der
Proteingehalt bestimmt werden, um die richtige
Menge an Enzym zusetzen zu können. Nach
dem Verdau der Proteine zu Peptiden werden
diese über eine HPLC-Anlage getrennt und nach
ES-Ionisation in das TQ-MS überführt. Im ersten
Quadrupol werden ausgewählte Ionisationsprodukte
über ihr Masse-zu-Ladung-Verhältnis
(m/z) selektiv durchgeschleust und im zweiten
Quadrupol, der Stoßzelle, fragmentiert (Product
Ion). Ausgewählte Product Ions werden wieder
über ihr m/z im dritten Quadrupol selektiert und
detektiert Dieses Messprinzip wird als „Multiple
Reaction Monitoring“ (MRM) bezeichnet.
Vorteile und Nachteile
der vorgestellten
Methoden im Vergleich
Fakt ist, dass der ELISA derzeit am häufigsten
in den Dienstleistungslaboratorien zum Einsatz
kommt und somit das primäre „Arbeitspferd“
darstellt. Dies liegt daran, dass die Methode
vergleichsweise einfach in der Durchführung
ist und quantitative Werte gepaart mit einer
sehr guten Sensitivität liefert. Die Möglichkeit
zum Multiplexing in einem einzigen Test ist
zwar nicht möglich, dennoch können zumeist
aus einem Extrakt viele Parameter parallel
angesetzt werden, so dass innerhalb von kürzester
Zeit abgesicherte Ergebnisse vorliegen
können. An diese Durchsatzkapazität kommt
kein anderes Verfahren heran. Die Kombination
aus Kosten und Nutzen machen dieses
Werkzeug auch für die Zukunft in der Routineanalytik
unersetzlich.
Aufgrund der einfachen, kostengünstigen
Durchführung und dem sehr schnellen Vorliegen
der Ergebnisse sind die LFDs zumeist in der
Nahrungsmittelindustrie vor Ort im Einsatz. Insbesondere
Wisch-/Tupferproben von Anlagen
und/oder Proben des ablaufenden Spülwassers
können qualitativ auf die Anwesenheit des Ziellebensmittels
untersucht werden. Innerhalb weniger
Minuten liegen verlässliche Aussagen über
die Reinigungseffizienz vor, die eine fundierte
Entscheidung bezüglich der Anwesenheit von
Allergenen ermöglichen.
Die Spezifität der Methoden ist eine Grundvoraussetzung,
da positive analytische Ergebnisse
zu folgenreichen Konsequenzen wie z.B. Annahmeverweigerungen
von Rohstoffen bis hin
zu Rückrufen von Produkten vom Verbraucher
führen können. Aufgrund der teilweise speziesübergreifend
hohen Ähnlichkeit von strukturellen
und funktionalen Proteinen sowohl tierischer
als auch pflanzlicher Lebensmittel kann es insbesondere
bei den immunologischen Verfahren zu
Problemen mit der Spezifität kommen. Allerdings
ist die generelle Aussage, dass immunologische
ELISA falsch positive Ergebnisse liefern, schlicht
falsch, denn die antikörperbasierten Tests haben
sich in den letzten Jahren deutlich verbessert und
das Vorhandensein einer potenziellen Kreuzreaktivität
ist stark parameterabhängig. Wichtig
ist letztlich, dass man das angewendete System
kennt und damit sinnvoll umgehen kann. Gibt es
zum Beispiel Probleme mit falsch positiven Ergebnissen,
dann kann diese Methode immer noch
hervorragend zum Screening eingesetzt werden.
Ergebnisse unterhalb der Nachweisgrenze
sind aussagekräftig und lediglich Positivbefunde
müssen mit einer zweiten Methode abgesichert
werden. Ohne Frage besitzt die Massenspektrometrie
ein wesentlich höheres Potential bezüglich
Spezifität als der ELISA und der LFD, weshalb sie
auf Proteinebene zur Absicherung von zweifelhaften
Ergebnissen ideal ist. Es scheint zudem als
ob diese Technik allmählich Einzug in die kommerzielle
Allergenanalytik erhält. Aufgrund der
hohen Kosten und der langen Zeit von der Aufarbeitung
bis zum Ergebnis dient diese Methode
derzeit aber nicht zur Bewältigung der Routineanalytik.
Trotz zahlreicher Publikationen fehlen
immer noch die einschlägigen Beweise, dass die
Methodik vergleichbar dem ELISA für die Vielzahl
an unterschiedlichsten Matrices funktioniert.
Ein weiterer Vorteil der MS ist, dass innerhalb einer
Analyse theoretisch alle allergenen Parameter
analysiert werden könnten. Allerdings ist durch
die sequenzielle Abarbeitung von Proben nur eine
eingeschränkte Probenanzahl pro Gerät möglich.
Ein Problem aller Methoden ist, das diese mitunter
anfällig gegenüber Matrixbestandteilen
und insbesondere den Verarbeitungsprozessen
von Lebensmittelprodukten sind, die zu Modifikationen
führen können. Häufig kommt es zudem
auch zu Denaturierungsvorgängen, die die
Proteine in unterschiedlichem Ausmaß schlicht
unlöslich machen und somit ein Problem für die
Extraktion darstellt. Das Ausmaß ist parameterabhängig
und zeigt sich zumeist in einer reduzierten
Wiederfindung, was die Analytik teilweise
erheblich beeinflussen kann. Da die Extraktion
aber bei allen Methoden vorausgeht, sind diese
Abbildung 3:. Schematische Darstellung der MS-Analyse. Extrahierte Proteine werden nach
Vorbehandlung enzymatisch verdaut und die Peptide chromatographisch mittels HPLC teilweise
getrennt. Nach positiver Ionisierung im MS werden die Peptide im ersten Quadrupol
(Q) aufgrund voreingestellter m/z Verhältnisse selektiert. Im zweiten Q erfolgt die Fragmentierung
und im dritten Q werden die Fragmente nochmals entsprechend ihres m/z Verhältnisses
selektiert und quantitativ erfasst.