kommerzielle ELISA für viele der kennzeichnungspflichtigen
18 1/2018 FOOD-Lab Qualitätsmanagement
Lebensmittel verfügbar.
Allergen-ELISA basieren zumeist auf dem
Sandwich-Format. Der für den Nachweis erforderliche
sandwichartige Aufbau aus „Fänger“-
Antikörper(n), Zielprotein und „Detektions“-
Antikörper(n) verleiht dem Testformat seinen
Namen. Dieser Aufbau ermöglicht in der Regel
einen ausreichend spezifischen und sensitiven
Nachweis des Zielallergens. Das messbare Signal
ist proportional zur anwesenden Antigenmenge.
Seltener zum Einsatz kommt das kompetitive
Format. Hierfür wird nur ein Epitop (Bindungsstelle)
am Zielprotein benötigt, so dass dieser
Test auch kleinere Bruchstücken detektiert
und deshalb hauptsächlich zum Nachweis von
hydrolysierten bzw. fermentierten Produkten
verwendet wird.
Bedingt durch die Bindung von wenigstens
zwei Antikörpern kann im Sandwichformat eine
höhere Spezifität erreicht werden. Das messbare
Signal aus der Substratkonvertierung ist bei dem
kompetitiven Format umgekehrt proportional
zu der anwesenden Antigenmenge.
Prinzip
Ausgehend von einer homogenen Probe erfolgt
im ersten Schritt (Extraktion) immer die Überführung
der Proteine aus der Probenmatrix in die
wässrige Phase der Extraktionslösung. Zur Unterstützung
können verschiedenste Zusätze und
Stabilisatoren zum Einsatz kommen. Dann erfolgt
die Inkubation der Antikörper mit dem Proteinextrakt
in sogenannten Kavitäten. Bei Anwesenheit
des Zielproteins kommt es zur Ausbildung
der spezifischen Antigen-Antikörperbindung. Es
folgen Waschschritte zur Entfernung überschüssiger
oder nicht gebundener Reagenzien, bevor
es in Abhängigkeit des Formates zur Zugabe des
Detektionsantikörpers oder direkt des Substrates
kommt. Letztlich erfolgt der eigentliche Nachweis
des allergenen Proteins immer über einen
Substratumsatz, der zumeist durch eine Enzymkopplung
über den (Detektions-)Antikörper ermöglicht
wird. Der Substratumsatz, der mit einer
Farbentwicklung einhergeht, kann photometrisch
vermessen werden. Die Extinktion der Messprobe
wird über eine Kalibrationskurve in einen
quantitativen Wert umgerechnet.
Schnelltest – LFD
Schnelltests sind prinzipiell ebenfalls sowohl
im Sandwich- als auch im kompetitiven Format
herstellbar. Faktisch spielen aber nur Tests im
Sandwich-Format eine Rolle. Diese sind von
diversen Anbietern für nahezu alle Parameter
verfügbar. Der Schnelltest ermöglicht im
Gegensatz zum ELISA nur qualitative Ergebnisse.
Die Durchführung ist nochmals drastisch
Abbildung 1: Schematische Darstellung des ELISA-Ablaufs im Sandwichformat. A: Kavität
mit beschichteten Antikörpern; B: Zielproteine gebunden am Antikörper; C: Ausbildung
des Sandwichformates nach Zugabe des enzymgekoppelten Antikörpers; D: Farbreaktion
des Substrats über gekoppelte Enzymaktivität
vereinfacht und benötigt bei manchen Herstellern
(beispielsweise die vom ifp Institut für
Produktqualität entwickelten und über Romer
Labs vertriebenen AgraStrip®-Allergenkits) keine
weiteren Geräte. Dadurch sind sie zum vor-
Ort-Nachweis prädestiniert.
Prinzip
Ähnlich der ELISA-Analytik erfolgt zuerst eine
Extraktion der Proteine. Dieser Extrakt wird in
Form eines gerichteten Flusses entlang der LFDMembran
geführt, wobei verschiedene Zonen
durchströmt werden. Die erste Zone enthält parameterspezifische
Antikörper, die mit kolloidalem
Gold konjugiert sind. Die Antikörper können bei
Vorhandensein eines Antigens an dieses binden
und bewegen sich als Komplex weiter entlang
der Membran. Während des Durchströmens
der Probenpositivlinie erfolgt eine Anreicherung
des „Sandwichkomplexes“ durch einen weiteren
immobilisierten allergenspezifischen Antikörper.
Diese Anreicherung führt ab einer gewissen Konzentration
der kolloidalen Goldpartikel zu einer
visuell erkennbaren Bande, die nur bei Anwesenheit
allergener Proteine entsteht.
In Fließrichtung befindet sich immer mindestens
eine zweite „Kontrolllinie“, die durch
direkte Anreicherung von goldmarkierten Antikörpern
den prinzipiellen Fluss der Probe über
die Positivlinie anzeigt. In Fließrichtung hinter
der Kontrolllinie befindet sich das Absorberpad,
das die anströmende Flüssigkeit aufnimmt.
LC-MS/MS
Der erste auf Massenspektrometrie (MS) basierte
Nachweis eines allergenen Lebensmittels
wurde bereits 2004 für Erdnuss beschrieben 8.
Seit Jahren steigen die publizierten Verfahren
zum Allergennachweis kontinuierlich, wobei auf
Abbildung 2: Schematische Darstellung des Aufbaus eines LFD, wobei die Farben unterschiedliche
Zonen/Bereiche des LFD darstellen: blau = Sample Pad; altrosa: Konjugatpad mit goldmarkierten
Antikörpern; weiß: analytische Membran; rot: Analytpositivlinie mit immobilisierten
anti-Analyt-Antikörper; lila: Kontrolllinie mit immobilisiertem Antikörper, der gegen den
goldmarkierten Antikörper gerichtet ist; hellbraun: Waste Pad zur Flüssigkeitsaufnahme.
A: Streifen (vor der Benutzung) mit immobilisierten parameterspezifischen Antikörpern mit
Goldkonjugat im Konjugatpad; B: Positives Ergebnis mit angereicherten Komplexen aus immobilisiertem
Antikörper, Antigen und goldmarkiertem Antikörper an der Positivlinie und
angereicherten goldmarkierten Antikörpern an der Kontrolllinie; C: Negatives Ergebnis mit
angereicherten goldmarkierten Antikörpern nur an der Kontrolllinie